技术丨质粒构建-同源重组怎么做？
2. 载体线性化
选择合适的目的基因插入区域，对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体上目的基因插入区域上下游20 bp区域内GC含量均在40 % ~ 60 %范围之内时，重组效率将达到最大。载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。
酶切方法载体线性化
反向PCR载体线性化
3. 重组酶连接
将线性化的载体和目的基因按对应比例混合，载体一般推荐0.03pmol，目的片段0.06pmol。具体添加量可由以下公式计算获得：
按照反应体系加入UvsXase和反应Buffer，37℃孵育30 min即可。
4. 重组质粒转化
a) 将10 μl重组产物加入100 μl感受态细胞 (常见的感受态细胞：TOP10、DH5α负责质粒的克隆)；
b) 冰上放置30 min；
c) 42°C热激45 sec后，立即置于冰上冷却2 ~ 3 min；
d) 加入800 μl无抗性LB培养基，200 rpm 37°C摇床摇45-60 min；
e) 离心弃出部分上清，剩余部分吹打混匀涂至抗性或者其他筛选平板上。
5. 单克隆筛选和测序
37°C培养过夜、挑取3-5单个克隆摇菌、菌落PCR或提取质粒后酶切鉴定、鉴定完毕后送质粒或菌液测序验证。
注意事项
载体构建时，目的基因长度不宜超过载体，若目的基因过长可进行分段PCR。
设计引物时同源臂的GC含量40-60 %，超出范围会影响重组效率。计算目的片段PCR扩增引物退火温度时，同源臂序列不参与计算Tm值，只需计算参与目的基因扩增的序列。
插入片段和线性化载体，推荐使用切胶回收方式进行纯化回收 (切胶时间最好控制在2min内)，使用Nanodrop/Onedrop等仪器检测核酸浓度。若浓度小于20 ng/μl，建议多做几管，合并在同一管回收，提高浓度。
重组连接时严格控制PCR产物与载体的添加量，目的片段长度大于载体时，最适载体与片段使用量的计算方式互换；线性化载体使用量50 ~ 200 ng，插入片段扩增产物使用量20 ~ 200 ng。当DNA 最适使用量超出，选择最低/最高使用量；若插入片段与载体长度短，理论投入量不高，但回收产物浓度很高时，则添加体积过少，影响移液准确度，建议按0.03pmol：0.06pmol的比例适当提高。
感受态转化实验时，注意重组质粒体积不能超过感受态体积的1/10，否则可能导致实验成功率降低。控制重组产物体积：感受态细胞体积=1：10。
常见问题分析
1. 重组转化后单克隆不生长或生长过少
核验载体和目的基因的大小，若目的基因大于5000bp，使用分段PCR扩增后再进行重组反应；
确定插入片段和载体的比例，纯化后的载体和片段根据公式定量计算添加比例；
保证反应温度适宜，反应时间充分，反应结束后立马进行转化；
选择效价高的感受态，空载质粒转化感受态细胞作为对照，检测感受态活性；
控制重组反应体系和感受态比例，若反应体系过少会造成移液误差，影响重组效率。
2. 菌落PCR没有条带
载体线性化不充分，建议延长酶切时间，酶切产物进行胶回收；
可能有杂菌生长，使用相同菌株未转化的培养物为阴性对照。阴性对照平板上背景菌落数越多，则需要筛选的假定转化子菌落就越多。
订购索引
订购通道：您可以联系当地销售或拨打订购热线：025-8565 3525。
如需了解更多产品，可以登录巨匠生物官网查询相关信息。返回搜狐，查看更多